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原位杂交天
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分钟。
2） 置换成30%的PBST溶液，放置5分钟
3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次
4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）
1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。
2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。
4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
2. 预杂交
1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。
2）用等体积的HYB+取代HYB－。
3）60℃水浴，预杂交4小时以上。
3. 杂交
1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..
2）60℃ 温浴过夜。注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。
癌组织原位杂交实验步骤：
1. 将准备做原位杂交的样本常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3--30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
适用场景
1、高灵敏度地检测蛋白-蛋白的交互作用；
2、寻找在蛋白-蛋白交互作用中起关键作用的结构域或活性位点；
3、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白；
4、寻找具有药1物治1疗作用的小分子多肽；
5、寻找调控蛋白质相互作用的化合物；
6、绘制蛋白质相互作用图谱。
酵母双杂交技术的优点
1、无需纯化蛋白；
2、检测在活1细胞内进行，可以在一定程度上代表体内的真实情况；
3、检测的结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用；
4、酵母双杂交系统可采用不同组织、器1官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，并能分析细胞质、细胞核等多种亚细胞部位的蛋白。
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