欢迎来到武汉科锐诺生物科技有限公司网站！
18627856353
原位杂交天
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分钟。
2） 置换成30%的PBST溶液，放置5分钟
3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次
4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）
1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。
2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。
4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
2. 预杂交
1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。
2）用等体积的HYB+取代HYB－。
3）60℃水浴，预杂交4小时以上。
3. 杂交
1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..
2）60℃ 温浴过夜。注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。
原位杂交杂交液注意事项：
（1）杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血1清白蛋白及载体DNA或RNA等。
（2）杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm降低，杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的杂交温度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。，所以杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的（尤其对双链核酸探针）。
在杂交液中加入牛血1清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。
滴加FITC-TSA：滴加FITC-TSA试剂，避光室温反应5min。后TBST洗3次×10min，PBS洗1次×5min。
DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片1剂封片。
镜检拍照：切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm,发蓝光；FAM(488)绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。）
扫一扫手机网站
在线客服
18627856353
635716867@qq.com